制備感受態細胞：

1、從37℃培養16-20h的平板中挑取一個單菌落（直徑2-3mm），轉到一個含有100mlLB或SOB培養基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養3h。一般經驗，1OD600約含有大腸桿菌DH1×109個/ml。

    為達到轉化，活細胞數務必少于108 細胞/ml，對于大多數大腸桿菌來說，這相當于OD600值為0.4左右。為保證細菌培養物的生長密度不致過高，可每隔15-20min測定OD600 來監測，用監測的時間及OD600 列一個圖表，以便預測培養物OD600值達到0.4的時間，當OD600值達到0.35時，收獲細菌培養物。

    在菌株和菌株之間，OD600值與每毫升活細胞數見的關系變化很大，因此有必要通過測定特異大腸桿菌的生長培養物在生長周期的不同時相的OD600值，并將各稀釋濃度的培養物鋪于物抗生素的LB瓊脂板以計算每一時相的活細胞數，從而使分光光度計讀數得到標準化。

2、將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培養物冷卻至.0℃。

3、于4℃用Sorvall GS3 轉頭以4100r/min離心10min，以回收細胞。

4、倒出培養液，將管倒置1min以使zui后的痕量培養液流盡。

5、每50ml初始培養液用30ml預冷的0.1mol/L MgCl2-CaCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉淀。

6、于4℃用Sorvall GS3 轉頭以4100r/min離心10min，以回收細胞。

7、倒出培養液，將管導致1min以使zui后的痕量培養液流盡。

8、每50mo初始培養物用2ml用并預冷的0.1mol/L CaCl2（或TFB）重懸每份細胞沉淀。

9、此時，可以按步驟10-16用新鮮制備的感受態細胞直接做轉化實驗，也可以將細胞凍存于-70℃。

轉化：

包括陽性和陰性對照

10、用冷卻的無菌吸頭從每份用CaCl2溶液制備的感受態懸液中西區200ul轉移到無菌離心管（17*100mm）中，每管加入DNA（用不超過10ul的體積，其中的DNA小于50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min。

11、將管放入預加熱至42℃的循環水浴中，恰恰放置90s，不要搖動管。

熱激是一個關鍵步驟，準確地達到熱敷溫度非常重要。

12、快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1-2min。

13、每管加800ulSOC培養基，用水浴將培養基加溫至37℃，然后將管轉移到搖床上，溫育45min，使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。

    復蘇期中應于37℃溫和地搖動細胞（用低于50r/min轉速的搖床）。

14、將適當體積（每個90mm平板達200ul）已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/L MgSO4和相應抗生素的SOB瓊脂培養基上。

    如果用四環素作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個單獨的平米上（或軟瓊脂中），可以現在微量離心機哈桑室溫離心20s以收集轉化菌，加100ulSOC重懸沉淀，輕輕混勻。

    重要：玻璃鋪菌器需先在乙醇在浸泡，然后在酒精燈上灼燒，待它涼至室溫后，才可將轉化菌輕輕地鋪在瓊脂板上。

    如檢查氨芐的抗性，用轉化菌鋪平板時密度應較低（每個90mm平板不超過104菌落），于37℃培養的時間按不超過20h。氨芐抗性的轉化體可將β-內酰胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域的。這樣，鋪平板時密度過高或培養時間按過長都會導致出血對氨芐敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨芐而用羧芐，以及將抗生素濃度從60ug/ml提高到100mg/ml,可使情況有所改善，但不能產地*之。抗氨芐的增加與平皿上所加的細菌數的增加并無線形比例關系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞釋放生長抑制物質的緣故。

15、將平板置于室溫直至液體被吸收。

16、倒置平皿，于37℃培養，12-16h后可出現菌落。